細(xì)菌在普通培養(yǎng)基中保存一般需要 每月 傳
代一 次 , 而且容易發(fā)生污染和變異 。 保存菌種**理想的方法為冷凍干燥法 , 可 以保存幾 年、 幾十年或者更長(zhǎng)的時(shí)間 , 而且可 以避免污染和變
異j[1 。 但是 , 冷凍干 燥設(shè)備昂貴 , 不是每一 個(gè)必
需的單位都能裝備上 , **使該法不能 普遍應(yīng)用 。
我們通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) , 利用超速
離心機(jī)原有的低
溫 冷凍系統(tǒng)和真空 抽氣系統(tǒng) , 不 加任何改裝 , 可
以 完成冷凍干燥過程 , 制備出冷凍干燥菌種 , 效
果良好 提供了一個(gè)一機(jī)多用 的冷凍干燥方法。
1 材料和方法
L l
材料
.1 L l 供試菌種 : 由中G藥品生 物制品檢定所菌種保存 中心提供 , 均為G際標(biāo)準(zhǔn)菌種 。
1. 1 . 2 培養(yǎng)
基:
普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)
基。
1. 1 . 3 超速離心 機(jī) : 日立 08 P 一 7 型 超速離心 機(jī)
(
P r e s e r v a t i v e e e n t r i
f u g e )
L L 4高頻探漏儀 : G P I 型 , 北 京儀器廠出品 。
.1 2
方法
L
.2 1 新鮮脫脂牛乳的制 備: 制備冷凍干燥菌
種需用脫脂牛乳作保護(hù)劑。 制備方法 : 取
4 ℃ 保藏的新鮮牛乳一袋
, 3 0 0 o r / m i
n 離心 沉淀 I O m i n 去除油脂層。 取此脫脂牛乳分裝于中試管 , 經(jīng) 0 . 7 0 k g c/ m
“ 高壓蒸汽滅菌 , 塞上無(wú)菌膠塞 , 4 C 冰箱存放備用 。
1 .
2 .
2 菌液制備: 將要冷凍干燥的菌種接種于
營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面 , 37 ℃ 培育18 一 24 h 。 刮取菌苔放人
3一
s lm 無(wú)菌脫脂牛乳中制成濃菌液
( 每毫升約含 20 億個(gè)菌 以上 ) , 按0 . 1一。 . 2 m l 量分裝于安瓶管中 , 進(jìn)行冷凍干燥。
L .2 3 冷凍干燥操作程序:
( 1) 預(yù)冷 : 檢查機(jī)器 , 將各轉(zhuǎn)鈕調(diào)置于 。位。
將 低限溫度指 針 ( 綠針) 調(diào)****低處 , 將高限溫度指針 ( 紅針 ) 調(diào)** 一
I O C 處 。 接上電源 , 打
開總開關(guān)和冷凍機(jī)開頭 , 使槽 內(nèi)溫度下降。 約 20 m in , 槽 內(nèi)溫度可 降** 一 03 C , 溫度指針 ( 黑
針 ) 到達(dá)**低處。
(2 ) 菌種速凍: 當(dāng)槽內(nèi)溫度到達(dá)一 03 C 以下時(shí) , 啟開冷凍槽平蓋 , 迅速放人裝有牛乳菌液的 安瓶管 , 并蓋嚴(yán)平蓋 , 繼續(xù)冷凍h2 。
(3 ) 冷凍干燥 : 打開真空泵 , 在一 03 C 下
抽 氣干燥h2 。 將低限溫度指針上調(diào)** 一
4 ℃ , 上
限 溫度指針上調(diào)** 十
S C , 繼續(xù)抽氣干 燥h2 。 將低限溫度指針上調(diào)**
1 8 C , 上限溫度指針上調(diào)** 24 C , 繼續(xù)抽氣干燥4h , 冷凍干燥完畢。 每次
使用后 , 部分水氣成為水珠下沉于油槽底部 , 需
從油 槽下端換油 孔的透明膠管中放出 。 當(dāng)放盡
水珠后 , 補(bǔ)上一 些新油即可再次使用 。
( )4 封
口 , 加簽 : 關(guān)閉真空泵和冷凍機(jī) , 打
開 冷凍槽平蓋 , 取 出凍干的安瓶管。 冷凍干燥 良好的菌種管原體積不變 , 呈白色干燥結(jié)構(gòu)。 將安
瓶 管逐個(gè)插人真空抽氣機(jī)的多頭皮管上 , 用本生燈或安瓶封 口 燈火焰逐支封 口 。 按菌種名稱
和批號(hào)貼上標(biāo)簽 , 置菌種盒于
4 ℃ 冰箱保存待
用 。
( )5 檢測(cè): 用 G P
I 型高頻探漏儀探測(cè)每支菌種管的真空度。 真空 度良好的菌種管會(huì)發(fā)藍(lán)
色熒光。 探測(cè)時(shí)間不宜過長(zhǎng) , 以免影 響菌種活
力。 活菌試驗(yàn) : 打開安瓶管 , 加人少量肉湯培養(yǎng)基 , 融化后取一滴接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上 , 或其他適宜培養(yǎng)基上 , 放 37 ℃ 溫 箱 中培育 24 一
4 8 h
, 觀察細(xì)菌的存活情況及其純度。
2 結(jié)果和討論
2 .
1 超速
離心機(jī)制備冷凍干燥菌種
兩 年中用此法冷凍干 燥 G際 標(biāo)準(zhǔn)菌種03
種
, 包括痢疾桿菌、 沙門氏桿菌、 假單胞菌、 埃
希氏菌、 鏈球菌、 亞 利桑那沙門氏菌等屬的細(xì)菌。 凍干保存一年后 隨機(jī)測(cè) 試了 18 種凍干的菌
種
, 即
: 志賀氏痢疾桿菌、 宋內(nèi)氏痢疾桿菌、 福
氏 痢疾桿菌、 傷寒桿菌、 腸炎沙門氏菌、 金 黃
色葡萄球菌、 甲型鏈球菌、 綠膿桿菌、 克雷伯
氏 肺炎桿菌、 致病性埃希氏大腸 桿菌、 亞利桑
那菌、 弗蘭地檸檬酸桿菌和 臘狀桿菌 。 結(jié)果全部
生長(zhǎng) 良好 。
2 .
2 超速
離心機(jī)凍干其他生物制荊
實(shí) 驗(yàn)證明 , 使用 此法將冷凍干燥時(shí)間延長(zhǎng)
到
1 4 h , 還可 以凍干較大容量的各種生物制劑。
我們以人血清和 脫脂牛乳做試驗(yàn) ,
5m l 安瓶裝
量 l m l , I O m l 安瓶裝量 Zm l , 底面積 2 5 X 4 5 m m
的組織培養(yǎng)瓶裝量
3 m l , 底面積5
又 85 m m 的組
織 培養(yǎng)瓶裝量
1 0 m l , 平放冷凍干燥
1 h4 , 可 以制
出 良好的凍干產(chǎn) 品。
由于本機(jī)冷凍槽較大 , 真空泵效力較高 , 使用本機(jī)不僅可以凍干菌種 , 使之長(zhǎng)期保存 , 而
且還適用于 中批量的凍干生物制劑的研究和生
產(chǎn) ,包括生物制劑 , 生物藥品和其他生物制品
的 研究和生 產(chǎn)。 一機(jī) 兩用 , 可 以節(jié)省 資金和 用
房 , 提高機(jī)器的利用率。
